RNA的保護(hù)

RNA的保護(hù)
與DNA提取實驗相比，RNA的提取實驗常常較為困難，這主要是由
于RNA非常容易降解。而造成RNA降解的原因來自內(nèi)因和外因兩個方
面。內(nèi)因：RNA核糖殘基的2’和3’位置帶有羥基，易被水解；外
因：生物體內(nèi)和外部環(huán)境中存在大量RNase，并且RNase不易失活，
高溫后仍然能夠正確折疊恢復(fù)活性。因此，從樣品的儲存、RNA的提取
以及RNA提取完成后的保存，我們都需要格外小心，處處防范RNase對
RNA的降解作用。下面，我們將介紹RNA提取過程中保護(hù)RNA的措施。
1、提取前的RNA保護(hù)
材料樣品中的RNA保護(hù)：一般而言，在收集材料樣品準(zhǔn)備提取RNA
時，我們首先應(yīng)該選擇新鮮的材料，取樣后迅速液氮研磨或勻漿處
理，以保證我們所要提取材料中的RNA本身是完整的。如果收集好
材料后，不能馬上進(jìn)行RNA的提取工作，就需要先將材料保存好，
冰凍材料保證低溫儲存，防止反復(fù)凍融，以保證材料中的RNA在保
存過程中不被降解。液氮低溫保存法是一種常用的保存方法。先將
材料在液氮中速凍后保存于-70℃冰箱或直接保存在液氮中。
實驗室中RNA提取工作區(qū)RNase的清除：自然界中的RNase含量非常
豐富，在空氣中會有許多RNase存在。因此，在RNA提取實驗中應(yīng)該
辟出RNA提取專區(qū)，該區(qū)域要進(jìn)行RNase的清除處理，同時要注意避
免同其它實驗區(qū)發(fā)生交叉污染。
實驗耗材、玻璃器皿上的Rnase的清除：所有提取RNA要用到的耗材
和器皿都要進(jìn)行RNase清除處理。使用無RNase的塑料制品、槍頭、
移液器、電泳槽等避免交叉污染，實驗臺面等要*處理。RNA處
在Trizol試劑中是不會被RNase降解的，但提取后的繼續(xù)處理過程中應(yīng)
使用不含RNase的塑料或玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小時以
上，塑料器皿可用DEPC處理后再高壓滅菌，即可去除RNase。實驗所
用的試劑或溶液，必須確保無RNase。配制溶液應(yīng)使用無RNase的水。
2、提取過程中的RNA保護(hù)
組織破碎過程中的RNA保護(hù)：選擇合適的勻漿方法，盡可能減少勻
漿的時間，保持低溫勻漿。在進(jìn)行細(xì)胞裂解之前，一般要先將組織
塊破碎。破碎所采用的方法主要有液氮研磨或勻漿處理。液氮研磨
時注意不要讓液氮揮發(fā)干凈，因為液氮可以充分抑制RNase，一旦
液氮揮發(fā)干凈，就可能造成內(nèi)源RNase對RNA的降解作用。
細(xì)胞裂解過程中的RNA保護(hù)：選擇合適的裂解液，裂解液的量要足
夠，裂解要充分。在裂解液加量一定的情況下，所加入的提取材料
的量就應(yīng)該按說明書中的比例加入，如果材料太多，會造成裂解不
充分和RNase抑制不充分的雙重后果，從而使RNA的得率、完整性
和純度都受到破壞。
實驗人員的注意事項：在提取RNA的過程中，實驗操作者本身也應(yīng)
該注意相關(guān)問題。因為我們的手上、唾液中都會有大量的RNase存
在，所以在進(jìn)行RNA提取實驗時，應(yīng)該戴上口罩，并及時更換手套。
這不僅是對RNA的保護(hù)措施，同的也是對實驗操作者自身的保護(hù)。
3、保存過程中的RNA保護(hù)
在經(jīng)過從材料采集到RNA提取等一系列精心地準(zhǔn)備和實驗之后，我
們終于得到了高質(zhì)量的RNA，那么接下來的RNA保存就成為重點
問題，而其中關(guān)鍵的問題就是如何避免保存過程中的RNA降解。
RNAsafe就是在RNA保存過程中常用的一種RNase抑制劑，它能夠高
效去除溶液中可能存在的RNase污染，保證RNA完整性不受破壞。
4、后續(xù)實驗中的RNA保護(hù)
RNA的提取歸根到底只是一個基礎(chǔ)實驗，這就意味著我們還要用
RNA來完成許多后續(xù)實驗，例如：RT-PCR，Northern blot，體外
轉(zhuǎn)錄和翻譯等。那么在這些后續(xù)實驗中，也需要對RNA進(jìn)行持續(xù)的保
護(hù)，RNasin就是在這類后續(xù)實驗中的應(yīng)用廣泛的RNase抑制劑。