原代組織細胞的解離

原代組織細胞的解離
從原代組織上獲取單個細胞懸液的常用方法是利用酶的解聚作
用。盡量縮短用酶處理細胞的時間，以獲得高的存活率。按下
面的方法解聚整個組織，以獲得大量細胞。
胰酶
1．先去除無關組織，然后用滅菌的解剖刀或剪刀將組織切成　　
　3-4mm大小碎塊。通過在不含鈣鎂的平衡鹽溶液進行重懸來清　
洗組織碎塊。待組織碎塊沉降后去掉上清液。重復清洗2-3次。
2．將裝有組織碎塊的容器置于冰上，去掉所有上清液。在不含鈣
鎂的平衡鹽溶液中加入0.25%胰酶（每100mg組織大約需要
1ml 胰酶）。
3．在4℃ 下孵育6-18小時，使低活性的胰酶盡量滲入組織。
4．緩慢倒掉胰酶。在37℃ 下將殘余的胰酶與組織碎塊共同孵育　
　20-30分鐘。
5．向組織碎塊加入溫熱的*培養基，并輕輕地吹吸以分散組　
　織。如果使用無血清培養基。還應加入大豆胰酶抑制劑。
6． 用滅菌的不銹鋼網（100-200μm）過濾細胞懸浮液，直至所有
組織*散開。計算細胞個數，然后接種細胞進行培養。
膠原酶
1．用滅菌的解剖刀或剪刀將組織切成3-4mm大小碎塊。用Hanks平衡
鹽溶液（HBSS）將組織碎塊清洗數次。
2．加入膠原酶（50-200單位/ml膠原酶HBSS）。
3．在37℃ 下孵育4-18小時。加入3mM CaCl2 可以提高解離效率。
4．用滅菌的不銹鋼網或尼龍網過濾細胞懸浮液，將離散的細胞和
組織片段與大塊的組織碎片分離。如需進一步解離，可向組織片
段中加入新鮮的膠原酶。
5．通過離心HBSS清洗細胞懸浮液數次。
6．用培養基重懸細胞。計算細胞個數，然后接種細胞進行培養。
分散酶
1．用滅菌的解剖刀或剪刀將組織切成3-4mm大小碎塊。用不含鈣
鎂離子的平衡鹽溶液清洗組織碎塊數次。
2．加入分散酶（0.6-2.4單位/ml分散酶不含鈣鎂的平衡鹽溶液）。
3．在37℃下孵育20分鐘至數小時。
4．用滅菌的不銹鋼網或尼友網過濾細胞懸浮液，將離散的細胞和
　組織片段與大塊的組織碎片分離。如需進一步解離，可向組織片
　段中加入新鮮分散酶。
5．通過離心平衡鹽溶液清洗細胞懸浮液數次。
6．用培養基重懸細胞。計算細胞個數，然后接種細胞進行培養。