科普小課堂|Masson三色染色總踩坑？這些FAQ幫你 “避坑通關(guān)”！
Masson三色染色總踩坑？這些FAQ幫你 “避坑通關(guān)"！
Masson三色染色的主要用途是什么？
用于區(qū)分組織中的膠原纖維（染藍(lán)色/綠色）、紅細(xì)胞/肌纖維/細(xì)胞質(zhì)（染紅色）和細(xì)胞核（染深棕/黑色）。常用于評(píng)估纖維化（如肝纖維化、腎小球硬化）、腫瘤間質(zhì)增生或肌肉病理研究。
經(jīng)典Masson三色染色的關(guān)鍵試劑是什么，分別有什么作用？
Bounis固定液
用于固定組織形態(tài)，效果良好，可以媒染膠原組織，增加染料滲透性和對(duì)比度（可使用改良媒染液替代）。
Weigert鐵蘇木素染色液
用于核染色，含鐵離子媒染，使蘇木素與核DNA牢固結(jié)合，耐酸清洗。
麗春紅品紅染色液
用于肌纖維染色，小分子酸性染料易滲透致密程度高的肌纖維將其染成紅色。
磷鉬酸
用于分化膠原纖維的麗春紅品紅染色效果，并強(qiáng)化膠原纖維疏松結(jié)構(gòu)，促進(jìn)苯胺藍(lán)結(jié)合，分化時(shí)間決定紅藍(lán)對(duì)比度。
苯胺藍(lán)染色液
用于膠原纖維染色，大分子酸性染料易滲透致密程度低的膠原纖維將其染成藍(lán)色。
弱酸溶液
用于麗春紅品紅和苯胺藍(lán)染色后清洗切片，弱酸性溶液可以起到固色作用，穩(wěn)定紅色與藍(lán)色著色。
G1346-改良Masson染色試劑盒相比于G1340-Masson染色試劑盒的優(yōu)勢(shì)是什么？
G1346優(yōu)勢(shì)主要體現(xiàn)在2個(gè)方面：
1. 使用天青石藍(lán)蘇木素，無需現(xiàn)用現(xiàn)配鐵蘇木素，操作更簡(jiǎn)單；
2. 使用環(huán)保無毒的媒染劑用于膠原纖維預(yù)處理，色彩更清晰鮮艷、纖維更加清晰、不易出現(xiàn)過染等。
兩款試劑盒均適用于組織的石蠟切片、冰凍切片等染色，且染色穩(wěn)定、色彩鮮艷。
G1340染色-小鼠腎石蠟切片
G1346染色-小鼠腎石蠟切片
G1340-Masson三色染色結(jié)束后整張片子整體顏色偏紫紅、膠原纖維藍(lán)色著色不清晰是什么原因？如何進(jìn)行調(diào)整？
原因分析1:
苯胺藍(lán)染色時(shí)間短、染色效果不夠，從而使紅色成為主導(dǎo)色，導(dǎo)致切片整體偏紫紅。
調(diào)整意見:
可以嘗試增加苯胺藍(lán)染色時(shí)間，每次以30s為遞增單位或者在磷鉬酸分化后，快速用蒸餾水清洗3-5s，然后再進(jìn)行苯胺藍(lán)染色。
原因分析2:
磷鉬酸分化不足導(dǎo)致膠原纖維有殘留麗春紅品紅著色，苯胺藍(lán)后續(xù)染色效果不佳。
調(diào)整意見:
可以嘗試增加磷鉬酸分化時(shí)間至2-3min。
G1340-Masson三色染色結(jié)束后整張片子整體顏色偏藍(lán)紫、肌纖維紅色著色不鮮艷是什么原因？如何進(jìn)行調(diào)整？
原因分析1:
苯胺藍(lán)染色時(shí)間長(zhǎng)、染色效果過度，從而使藍(lán)色成為主導(dǎo)色，導(dǎo)致切片整體偏藍(lán)。
調(diào)整意見:
可以嘗試增加麗春紅品紅染色時(shí)間，同時(shí)減少苯胺藍(lán)染色時(shí)間（先以2min為基礎(chǔ)進(jìn)行染色，然后根據(jù)結(jié)果再調(diào)整時(shí)間）。
原因分析2:
磷鉬酸分化過度導(dǎo)致肌纖維紅色著色不牢，再進(jìn)行苯胺藍(lán)染色后被遮蓋。
調(diào)整意見:
可以嘗試減少磷鉬酸分化時(shí)間至0.5-1min。
染色結(jié)果不能及時(shí)封片應(yīng)該如何保存？封片后可以保存多久？
如染色后不能及時(shí)封片，可以先將切片置于弱酸溶液里暫時(shí)保存幾個(gè)小時(shí)（若觀察到有明顯顏色溶出現(xiàn)象，需要及時(shí)拿出，然后梯度乙醇快速脫水封片），中性樹膠封片后的樣本一般可以保存至少6個(gè)月，但還是建議等樹膠凝結(jié)干燥之后及時(shí)拍照留存結(jié)果，防止長(zhǎng)期保存過程中蓋玻片污染從而影響后續(xù)觀察。
該試劑盒用于冰凍切片染色時(shí)有哪些注意事項(xiàng)？
1. 由于冰凍切片較比石蠟切片易上色，而且不同組織的染色時(shí)間也不同，所以需要調(diào)整各步驟的染色/處理時(shí)間，對(duì)于易上色組織樣本，可將每一步的染色時(shí)間減半來染色；
2. 在苯胺藍(lán)染色這一步，需要用弱酸溶液將苯胺藍(lán)稀釋3-5倍后使用，否則容易出現(xiàn)過染現(xiàn)象；
3. 染色和清洗切片時(shí)，操作手法盡量輕柔小心，以免組織脫落或翻起；
4. 冰凍切片較石蠟切片組織厚好幾倍，最終呈現(xiàn)的染色結(jié)果鮮艷度可能會(huì)遜色于石蠟切片為正常現(xiàn)象。
染色背景有雜質(zhì)或污濁是什么原因？
1. 脫蠟不充分，可能存在殘留蠟質(zhì)，建議增加烤片時(shí)間或更換新的二甲-苯試劑或環(huán)保組織透明脫蠟液；
2. 試劑存在沉淀，如果不確定是否是沉淀，可以吸取50μL液體置于干凈的載玻片上，于顯微鏡下觀察是否有大量懸浮顆粒或不溶性物質(zhì)，如果是沉淀，但不多，可以使用濾紙或針頭濾器過濾除雜后再使用。
石蠟切片染色封片放置幾天后出現(xiàn)褪色或顏色明顯變淺情況是為什么？如何避免這種現(xiàn)象？
可能由于封片前無水乙醇脫水和二甲-苯透明步驟使用的試劑由于多次使用摻入了一定量的水分，導(dǎo)致紅色或藍(lán)色著色被溶解，建議更換新的乙醇和二甲-苯進(jìn)行處理或者苯胺藍(lán)染色后弱酸清洗這一步驟，及時(shí)甩干水分，直接晾干后再用中性樹膠封片，不進(jìn)行脫水透明。
同一個(gè)組織的相鄰切片同時(shí)染色后出現(xiàn)顏色不一情況怎么辦？
由于Masson三色染色步驟繁多，如果是采取滴染方式，存在這種情況屬于正常現(xiàn)象，由于人為操作誤差，在依次處理切片時(shí)會(huì)有一些細(xì)微時(shí)間差異導(dǎo)致著色程度有所偏頗。可以通過減少一次性染色處理的切片數(shù)量或者采取浸染（缸染或小型直立切片孵育盒）的方式進(jìn)行染色，盡量確保每一步處理的時(shí)間保持一致從而減少批間差異。浸染的試劑如麗春紅品紅染液和苯胺藍(lán)染液可以回收2-3次使用，但不推薦反復(fù)使用。