滿滿的干貨（三）：質粒DNA的提取，困難解決了嗎？

綜合前兩期的“滿滿的干貨（一）"和“滿滿的干貨（二）"，大家對于質粒DNA的提取應該會有一定程度的了解，那么在使用過程中，很多人覺得自己提取的質粒效果還是很差，究竟是怎么回事呢？

本期給大家在準備了一些質粒DNA提取時需要注意的事項，這些結果包含了濃度偏高或低的原因及解決方案：

原因及解決方案

01質粒濃度偏高

存在RNA殘留：未充分消化RNA（RNase A失效或未添加），導致A260值虛高。

解決方案

提取前一定要在溶液Ⅰ中加入RNase A，如果已加完RNase A的溶液Ⅰ在冰箱放置久了，一定要補加RNase A。

02細菌培養狀態不佳

• 細菌密度過低：若細菌培養液OD值（如OD600）未達到對數生長期后期（通常1.0-1.5），菌體數量不足，會直接導致質粒總量減少。

• 培養時間過長：超過對數生長期后，細菌進入穩定期或衰退期，可能釋放核酸酶降解質粒，同時菌體裂解難度增加。

• 細菌污染，若培養液中混入雜菌，雜菌會爭奪營養，導致目標細菌生長受抑，同時可能釋放酶類破壞質粒。

• 菌液長期存放。

解決方案

（1）調整培養時間至12-16小時，但避免過度生長導致質粒丟失。

（2）確保使用合適的培養基（如LB）和正確的抗生素濃度。

（3）接種前用新鮮活化的單菌落，避免使用陳舊或多次傳代的菌液。

03質粒拷貝數低

• 某些質粒（如大質粒或低拷貝質粒）天然拷貝數低（如pBR322為低拷貝）。

• 插入片段過大（>10kb）導致復制效率下降。

解決方案

（1）選擇高拷貝質粒載體。

（2）若需保留低拷貝質粒，可增加培養體積（如從5mL增至10-20mL），提高質粒總量。

04質粒降解

在提取過程中，如果操作環境存在核酸酶（如DNase、RNase），或者提取過程中劇烈震蕩、溫度變化過大等，可能會導致質粒降解，使提取的質粒濃度降低。

解決方案

（1）在提取過程中，使用無核酸酶的試劑和耗材，如無核酸酶的水、無核酸酶的離心管等。

（2）操作時動作要輕柔，避免劇烈震蕩。嚴格控制溫度，尤其是在裂解和洗脫等關鍵步驟。

原因及解決方案

05裂解不充分

菌液量過多。

堿裂解（Solution II）時間過短：無法充分破壞細菌細胞膜和釋放質粒；時間過長（超過5分鐘）：會導致基因組DNA斷裂并與質粒共沉淀，同時強堿可能降解質粒。

裂解液未混勻。

解決方案

（1）采用適量的菌液量進行提取。

（2）確保充分裂解，但時間不要超過5分鐘。

（3）加完Solution II一定要輕柔且充分混勻。

06中和與離心不充分

• Solution III未充分混勻，質粒復性不充分；

• 離心轉速/時間不足（如<12,000rpm或<10分鐘），沉淀未分離。

解決方案

（1）加入Solution III后，立即顛倒混勻8-10次，直至出現均勻白色絮狀沉淀。

（2）12,000-13,000rpm離心10-15分鐘，確保充分沉淀。

07洗脫液使用不當

• 洗脫液體積過大。

• 洗脫液pH不合適。

• 洗脫溫度不足：未將洗脫液預熱至60℃左右，低溫會降低質粒從硅膠膜上的解離效率。

• 加完洗脫液未靜置直接離心。

解決方案

（1）洗脫時調整洗脫液添加體積，洗脫液體積過大會稀釋濃度；體積過小則無法充分濕潤硅膠膜，導致質粒洗脫不充分。

（2）洗脫液（ddH2O或TE緩沖液）pH偏酸性（<7.0）會降低質粒溶解度，影響洗脫效率，建議pH8.0-8.5。

（3）洗脫液加入后需靜置1-2分鐘，質粒充分溶解并釋放后再離心。

08操作損耗

• 離心后上清未充分吸棄，稀釋菌體。

• 重懸緩沖液（Solution I）未充分混勻，菌體沉淀未分散。

解決方案

（1）菌體離心后，用移液器充分吸盡上清（殘留量<10μL）。

（2）加入Solution I后，用渦旋儀或移液器反復吹打至沉淀充分分散（無可見顆粒）。

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