了解DiI 細(xì)胞膜橙色熒光探針的原理和使用

DiI即DiIC18(3)，全稱為1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate，是常用的細(xì)胞膜熒光探針之一，呈現(xiàn)橙紅色熒光。DiI是一種親脂性膜染料，進(jìn)入細(xì)胞膜后可以側(cè)向擴(kuò)散逐漸使整個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞膜被染色。
DiI在進(jìn)入細(xì)胞膜之前熒光非常弱，僅當(dāng)進(jìn)入到細(xì)胞膜后才可以被激發(fā)出很強(qiáng)的熒光。DiI被激發(fā)后可以發(fā)出橙紅色的熒光，DiI和磷酯雙層膜結(jié)合后的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。其中，最大激發(fā)波長為549nm，最大發(fā)射波長為565nm。
DiI可以溶解于無水乙醇、DMSO和DMF，溶解度約為1-2.5mg/ml。發(fā)現(xiàn)較難溶解時(shí)可以適當(dāng)加熱，并用超聲處理以促進(jìn)溶解。
DiI被廣泛用于正向或逆向的，活的或固定的神經(jīng)等細(xì)胞或組織的示蹤劑或長期示蹤劑(long-termtracer)。DiI通常不會(huì)影響細(xì)胞的生存力(viability)。被DiI標(biāo)記的神經(jīng)細(xì)胞在體外培養(yǎng)的條件下可以存活長達(dá)4周，在體內(nèi)可以長達(dá)一年。DiI在經(jīng)過固定的神經(jīng)元細(xì)胞膜上的遷移速率為0.2-0.6mm/day，在活的神經(jīng)元細(xì)胞膜上的的遷移速率為6mm/day。
DiI除了簡單的細(xì)胞膜熒光標(biāo)記外，還可以用于檢測細(xì)胞的融合和粘附，檢測發(fā)育或移植過程中細(xì)胞遷移，通過FRAP(Fluorescence Recovery After Photobleaching)檢測脂在細(xì)胞膜上的擴(kuò)散，檢測細(xì)胞毒性和標(biāo)記脂蛋白等。
用于細(xì)胞膜熒光標(biāo)記時(shí)，DiI的常用濃度為1-25μM，常用的濃度為5-10μM。DiI可以直接染色活的細(xì)胞或組織，染色時(shí)間通常為5-20分鐘。對(duì)于固定的細(xì)胞或組織，通常宜使用配制在PBS中的4%多聚甲醛進(jìn)行固定，使用其它不適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ簳?huì)導(dǎo)致熒光背景較高。
1. DiD，DiO，DiI，DiR 和 DiS 細(xì)胞膜染色液制備
(1) 配置 DMSO 或 EtOH 儲(chǔ)存液：儲(chǔ)存液用 DMSO 或 EtOH 配置濃度 1～5 mM。
(2) 注意：未使用的儲(chǔ)存液保存在-20℃，避免反復(fù)凍融。 (3) 工作液制備：用合適的緩沖液(如：無血清培養(yǎng)基，HBSS 或 PBS)稀釋儲(chǔ)存液，配制濃度為 1～5µM 的工 作液。   注意：工作液的最終濃度是根據(jù)不同細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)來配制。可以從推薦濃度的十倍以上尋找最佳條件。
2. 懸浮細(xì)胞染色
(1) 懸浮細(xì)胞密度為 1 × 106/mL 加入到工作液中。
(2) 在 37 ℃培養(yǎng)細(xì)胞 2～20 分鐘，不同的細(xì)胞最佳培養(yǎng)時(shí)間不同。
(3) 染色細(xì)胞試管在 1000～1500 轉(zhuǎn)離心 5 分鐘。
(4) 傾倒上清液，再次緩慢加入預(yù)溫 37℃的培養(yǎng)液。
(5) 重復(fù)(3)，(4)步驟兩次以上。
3. 粘壁細(xì)胞的染色
(1) 使粘壁的細(xì)胞在無菌實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)。
(2) 從培養(yǎng)基中移走蓋玻片，吸走過量培養(yǎng)液，將蓋玻片放在潮濕的環(huán)境中。
(3) 在蓋玻片的一角加入 100µL的染料工作液，輕輕晃動(dòng)使染料均勻覆蓋所有細(xì)胞。
(4) 在 37 ℃培養(yǎng)細(xì)胞 2～20 分鐘，不同的細(xì)胞最佳培養(yǎng)時(shí)間不同。
(5) 吸干染料工作液，用培養(yǎng)液洗蓋玻片 2～3 次，每次用預(yù)溫的培養(yǎng)基覆蓋所有細(xì)胞，培養(yǎng) 5～10 分鐘，然 后吸干培養(yǎng)基。

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