丙酮酸脫羧酶（PDC）測試盒 微量酶標(biāo)儀法 說明 技術(shù) 文章

丙酮酸脫羧酶（PDC）活性檢測試劑盒

商品貨號：MS1006
英文名稱：Micro Pyruvate Decarboxylase (PDC) Assay Kit
別名：丙酮酸脫羧酶試劑盒 PDC Kit 丙酮酸脫羧酶（PDC）試劑盒 丙酮酸脫羧酶（PDC）測試盒
檢測方法：微量法

測定意義：

PDC主要存在于酵母中，是乙醇發(fā)酵的關(guān)鍵酶之一，催化丙酮酸脫羧生成乙醛。

測定原理：

PDC催化丙酮酸脫羧生成乙醛，添加乙醇脫氫酶（ADH）來進一步催化NADH還原乙醛生成乙醇和NAD+；NADH在340nm有吸收峰，而NAD+沒有；通過測定340nm光吸收下降速率，來計算PDC活性。

貨號：MS1006                                                    規(guī)格：100管/96樣

丙酮酸脫羧酶（PDC）活性測定試劑盒說明書

微量法

注意：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義：

PDC主要存在于酵母中，是乙醇發(fā)酵的關(guān)鍵酶之一，催化丙酮酸脫羧生成乙醛。

測定原理：

PDC催化丙酮酸脫羧生成乙醛，添加乙醇脫氫酶（ADH）來進一步催化NADH還原乙醛生成乙醇和NAD⁺；NADH在340nm有吸收峰，而NAD⁺沒有；通過測定340nm光吸收下降速率，來計算PDC活性。

自備實驗用品及儀器：

研缽、冰、臺式離心機、紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體×1 瓶，4℃保存。

試劑二：液體×1 瓶，4℃保存。

試劑三：液體×1 瓶，4℃保存。

試劑四：液體×1 瓶，﹣20℃保存。

混合試劑：臨用前配制，小心把試劑四轉(zhuǎn)移到試劑三中，充分溶解。

試劑六：液體×1 管，4℃保存。

粗酶液提取：

1、細(xì)菌或細(xì)胞處理：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照每200萬細(xì)菌或細(xì)胞加入400μL提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率200W，工作3s，間歇10s，工作35次），16000g 4℃離心20min，取上清，置冰上待測。

2、組織處理：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿，16000g 4℃離心20min，取上清，置冰上待測。

3、血清（漿）樣品：直接檢測。

PDC 測定操作：

1.分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長到340nm，蒸餾水調(diào)零。

2.試劑二置于25℃水浴中預(yù)熱30min。

3.空白管：依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL蒸餾水、20μL混合試劑、140μL試劑二和20μL試劑六，迅速混勻后于340nm比色，記錄15s和75s的吸光值，分別記為A1和A2。

4.測定管：依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL上清液、20μL混合試劑、140μL試劑二和20μL試劑六，迅速混勻后于340nm比色，記錄15s和75s的吸光值，分別記為A3和A4。

注意：空白管只需測定一次。

PDC 活性計算：

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1）按照蛋白濃度計算

活性單位定義：25℃中，每毫克蛋白每分鐘催化1μmolNADH 氧化為1個酶活單位。

PDC (μmol/min/mg prot) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V 總×10⁶}÷(Cpr×V樣)÷T

=1.61×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計算

活性單位定義：25℃中，每克組織每分鐘催化 1μmol NADH 氧化為 1 個酶活單位。

PDC(μmol/min/g) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V 總×10⁶}÷(W×V樣÷V樣總) ÷T

=1.61×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷W

（3）按細(xì)胞數(shù)量計算

活性單位定義：25℃中，每10⁴個細(xì)胞每分鐘催化1μmol NADH 氧化為1個酶活單位。

PDC (μmol/min/10⁴cell) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V 總×10⁶}÷(細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總)÷T=1.61×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按血清（漿）體積計算

活性單位定義：25℃中，每毫升血清（漿）每分鐘催化1μmol NADH氧化為1個酶活單位。

PDC (μmol/min/mL) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V 總×10⁶}÷V 樣÷÷T

=1.61×[(A3－A4)－(A1-A2)]

ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V 總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL=2×10^-4 L，V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，0.02mL；V 樣總：提取液體積，1 mL；Cpr：蛋白濃度（mg/mL），需要另外測定，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量試劑盒；W ：樣品質(zhì)量； T：反應(yīng)時間，1 min。

b.使用96孔板測定的計算公式如下

（1）按照蛋白濃度計算

活性單位定義：25℃中，每毫克蛋白每分鐘催化1μmol NADH氧化為1個酶活單位。

PDC (μmol/min/mg prot) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V 總×10⁶}÷(Cpr×V 樣) ÷T=3.22×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計算

活性單位定義：25℃中，每克組織每分鐘催化 1μmol NADH 氧化為1個酶活單位。

PDC (μmol/min/g) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V 總×10⁶}÷(W×V 樣÷V 樣總) ÷T=3.22×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷W

（3）按細(xì)胞數(shù)量計算

活性單位定義：25℃中，每10⁴個細(xì)胞每分鐘催化1μmol NADH氧化為1個酶活單位。

PDC (μmol/min/10⁴cell) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V 總×10⁶}÷(細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總)÷T=3.22×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按血清（漿）體積計算

活性單位定義：25℃中，每毫升血清（漿）每分鐘催化1μmol NADH 氧化為1個酶活單位。

PDC (μmol/min/mL) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V 總×10⁶}÷V 樣÷÷T

=3.22×[(A3－A4)－(A1-A2)]

ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm；d：96孔板光徑，0.5 cm；V 總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL=2×10 ^-4 L，V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，0.02mL；V 樣總：提取液體積，1 mL；Cpr：蛋白濃度（mg/mL），需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量試劑盒；W ：樣品質(zhì)量； T：反應(yīng)時間，1min。

注意事項：配制好的混合液3天內(nèi)使用完。